Akcja toczy się, tak jak w poprzednich grach z Człowiekiem-Pająkiem w roli głównej, na Manhattanie. Tym razem, Nowy Jork opanowały groźne symbionty, infekujące, tajemniczą substancją, ludzi i otoczenie. W tej sytuacji, aby uratować miasto przed zagładą, nasz super bohater po raz kolejny musi stanąć do walki ze złem, tym razem korzystając,w zależności od wyboru dokonywanego przez gracza, z pomocy dawnych znajomych - zarówno tych dobrych, jak i złych – oraz obywatelskiej organizacji S.H.I.E.L.D.
Web of Shadows pozwala na swobodne poruszanie się po mieście - autorzy pozwolili, aby walki prowadzone przez Spider-Mana odbywały się również na ścianach budynków. Nasz bohater przed potyczką ma wybór pomiędzy strojami – czerwony ubiór zapewnia zwinność, czarny dodaje nadludzką siłę, a w trakcie gry może je ulepszać.